PVDF膜
剛開始做WB的人也許會(huì)有這種疑問:為什么實(shí)驗(yàn)室的老師(或者師兄師姐們)在教我們做WB的時(shí)候,如果是用PVDF膜做,總是小心翼翼的剪,節(jié)省著用,甚至一些邊邊角角也舍不得丟掉呢?其實(shí),這不僅是因?yàn)镻VDF膜比較貴,還由于PVDF膜是做WB的“*”。
聚偏二氟乙烯(PVDF)膜作為基質(zhì)的轉(zhuǎn)印膜由Millipore公司在1985年首先推出。與硝酸纖維素膜相比,PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力,機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)相容性上都更*的性能(Pluskal,et al.,1986)。市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜結(jié)合量是100-200μg/cm2(而結(jié)合強(qiáng)度PVDF比硝纖膜強(qiáng)6倍?。?。在艾滋病毒(HIV)血清學(xué)檢驗(yàn)中直接比較PVDF和硝酸纖維素膜,PVDF膜具有更好的截留總HIV抗原能力并提高抗體檢測糖基化被膜抗原的性能。但是PVDF膜zui大的優(yōu)點(diǎn)不僅于此:更好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測中成為理想選擇;而且單個(gè)凝膠的泳道復(fù)本可用于多種目的,如考馬斯亮藍(lán)染色后切出條帶并進(jìn)行N-末端測序、蛋白消化/肽分離/內(nèi)部測序和免疫檢測(Kurien,et al.,2003)。特別是需要做N端蛋白測序,在相當(dāng)“嚴(yán)酷”的清洗條件下,當(dāng)尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色,笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白測序的*選擇。此外,個(gè)人經(jīng)驗(yàn),一些強(qiáng)疏水蛋白用PVDF膜效果會(huì)更好一些。PVDF膜適用的檢測方法也不少,化學(xué)發(fā)光、常規(guī)顯色、同位素和標(biāo)準(zhǔn)染色都一樣OK,但不適合熒光。PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預(yù)處理(不超過15秒)再用緩沖液平衡,才能用,而且適用過程中萬一干了也要同樣程序再處理(不過要真出現(xiàn)這種問題也是自己欠扁,誰要你不小心呢,轉(zhuǎn)膜前處理也就罷了,轉(zhuǎn)膜后再這樣處理可能會(huì)影響后繼的抗體識(shí)別呢)。PVDF膜同樣分0.45um和0.2um的,后者孔徑小,對小分子蛋白有較好的攔截吸附,背景可能會(huì)比前者稍高。
PVDF膜常見的有以下幾個(gè)品牌
公司 | 產(chǎn)品名 | 孔徑 | 適用范圍 | 參考價(jià)格 |
Millipore | Immobilon Transfer Membranes | 0.45um 0.2um |
| 2050.00 |
Bio-Rad | Immun-Blot PVDF Membrane |
| Chemiluminescent, colorimetric western blots, amino-terminal sequence and total amino acid composition |
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Pierce | PVDF Membrane | 0.45um 0.2um | Western, Southern, Northern, and dot blots |
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Pall Life Science | BioTrace PVDF Transfer Membrane | 0.45um | Nucleic acid and protein transfers. Protein sequencing | 2200.00 |
Invitrogen | PVDF Membrane | 0.45um | Protein sequencing, immunoblotting |
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Whatman | Westran Clear Signal PVDF Membrane | 0.45um | Western blots |
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作為PVDF膜的鼻祖,Millipore公司的PVDF膜Immobilon系列分為Immobilon-P(0.45um), -PSQ(0.2um), -FL(用于熒光顯色)和Blotting Sandwiches for High Troughput四種。Immobilon-P膜孔徑均一,具有*的吸附能力,染色性能好、抗溶劑能力強(qiáng)和信噪比高,有助于提高檢測靈敏度,而且開放的孔結(jié)構(gòu)容易接近被吸附的蛋白質(zhì),并有助于去除背景上沒有吸附的探針,可以說是免疫印跡檢測理想的印跡膜。Immobilon-PSQ轉(zhuǎn)印膜是印跡小分子蛋白質(zhì)(<20KDa)的理想選擇——優(yōu)良的蛋白質(zhì)吸附性能,滲漏少。內(nèi)表面面積較大,可供蛋白質(zhì)吸附從而提高蛋白質(zhì)測序的得率。由于不含污染性支撐物或表面活性劑,Immobilon-PSQ層析譜上的背景峰值極小。Immobilon-FL也是Millipore值得驕傲的產(chǎn)品,因?yàn)檫@是*個(gè)專門為熒光顯色優(yōu)化的轉(zhuǎn)移膜。通過實(shí)驗(yàn)證明,這種膜在Kodak成像系統(tǒng)可以顯示僅7ng的蛋白,聽起來不錯(cuò)吧,有興趣可以試一試。這幾種膜除了一般的PVDF膜的優(yōu)點(diǎn)之外,zui大特點(diǎn)就是一個(gè)字——快。按照Millipore的操作手冊,Immobilon可以在保證質(zhì)量的前提下縮短WB時(shí)間到2個(gè)小時(shí)——主要是縮短封閉和洗脫時(shí)間。這可真是個(gè)好消息,因?yàn)樽谀莾旱萕B結(jié)果多浪費(fèi)時(shí)間?。】s短這個(gè)費(fèi)時(shí)而枯燥的過程,早出結(jié)果,可以提高實(shí)驗(yàn)效率,利于我們分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,考慮下步對策嘛。卷膜經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,裁剪剩下的邊角料還可以用來做點(diǎn)雜交,而預(yù)裁剪的即用膜更適合高通量等等“用金錢換時(shí)間”的實(shí)驗(yàn)。再次強(qiáng)調(diào)的是,疏水PVDF膜在用前必須經(jīng)過50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分鐘,待膜變成半透明后用MilliQ水或者純水漂洗一下,轉(zhuǎn)入電泳緩沖液平衡才能用。
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